УДК 534.29

Кровь – важнейшая интегрирующая система, которая обеспечивает обмен метаболитами и информацией между тканями и клетками, пластическую и защитную функции организма. Протекая по закрытому контуру, кровь контактирует со всеми органами. Общая поверхность капилляров человеческого организма составляет около 1 000 кв.м.

Многообразие и важность функций, огромная протяженность приводят к значительной уязвимости системы кровообращения. Гемостаз призван поддерживать нормальное агрегатное состояние крови. Изменения в системе гемостаза могут стать причиной развития как геморрагических, так и тромботических состояний, которые возникают у пациентов с самыми разными заболеваниями.

Огромное значение системы гемостаза в патогенезе заболеваний современного человека доказывается статистикой: такие гемостатические нарушения, как атеротромбоз и диссеминированное внутрисосудистое свёртывание, являются причиной смерти более чем в половине всех случаев.

Неконтролируемое применение препаратов, прямо или косвенно воздействующих на гемостаз, может оказаться опаснее самого заболевания. Поэтому лабораторная диагностика состояния системы гемостаза является важнейшим фактором эффективности лечения многих заболеваний и снижения смертности населения. Современная лабораторная диагностика основана на понимании общебиологических закономерностей функционирования системы гемостаза и выбора адекватных методов их оценки.

Исследованию гемостаза в последние годы уделяется большое внимание: появляются новые диагностические методы, лекарственные препараты, схемы лечения больных. В то же время лабораторная практика в изучении системы гемостаза в нашей стране развивается недостаточно динамично.

Необходима разработка и применение методов и технических средств лабораторной диагностики, позволяющих упростить, автоматизировать и сократить время проведения исследований параметров гемостаза [1].

Мы считаем возможным применение акустоэлектронных методов для исследования параметров гемостаза.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Разработан лабораторный макет для контроля протромбинового (ПТВ) и активированно-го частичного тромбопластинового (АЧТВ) времен (рис. 1), включающий генератор Г4-102, двухлучевой осциллограф С1-75, ультразвуковые (УЗ) излучатель (1) и датчик (5), которые размещались на одной оси с противоположных сторон кюветы (2, 4) с исследуемой средой (плазмой) (3).

В качестве УЗ датчика и излучателя использовался пьезокерамический излучатель-приемник прямоугольной формы (2×3 мм) производства НВРУП «Элкерм», рассчитанный на резонансную частоту 1 МГц.

Рис. 1. Схема контроля затухания амплитуды ультразвука при исследовании параметров гемостаза

При работе устройства контроля затухания амплитуды ультразвука электрический сигнал с генератора Г4-102 преобразовывался в акустический ультразвуковым излучателем (1) и проходил через стенки кюветы (2 и 4) с исследуемой средой (3). Акустический сигнал преобразовывался в электрический ультразвуковым датчиком (5), значение амплитуды сигнала фиксировалось на осциллографе С1-75.

Исследования проводились по двум разработанным методикам для определения АЧТВ и ПТВ с помощью ультразвуковых колебаний, основанных на стандартных методиках [2].

Протромбиновое время – широко используемый скрининговый тест для оценки внешнего каскада свертывания плазмы. ПТВ обычно используется для контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами, при скрининге системы гемостаза.

АЧТВ используется как скрининговый тест для оценки внутреннего каскада свертывания плазмы, скрининговой диагностики волчаночного антикоагулянта и слежения за антикоагулянтным действием гепаринов. АЧТВ – более значимый тест для первичного выявления патологии, чем ПТВ, так как выявляет относительно часто встречающуюся гемофилию А и В (дефицит факторов VIII и IX соответственно) и наличие волчаночного антикоагулянта [1].

Методика оценки протромбинового времени

Для измерения ПТВ использовался набор для определения протромбинового времени К-251 (PZ Сormay S.A. (Польша)).

Одноэтапный анализ ПТВ заключается в измерении времени свертывания плазмы после добавления тканевого фактора (тромбопластина) с кальцием. Рекальцификация плазмы в присутствии тканевого фактора порождает активированный Фактор Xa (F.Xa). F.Xa в свою очередь активизирует протромбин в тромбин, который превращает фибриноген в нерастворимый фибриновый сгусток.

Перед непосредственным анализом производили растворение Тромбопластина PT-S  дистиллированной водой в объеме, указанном на флаконе (4 или 10 мл). Легко помешали и оставили флакон на 15 минут при комнатной температуре. Легко смешивали перед каждым использованием.

После подготовки реагента подогрели Тромбопластин PT-S до 37ОС. Для подогрева проб использовался блок подготовки проб РТ 2110G (рис.2). Затем добавили 0,1 мл тестовой плазмы в кювету (см. рис. 1), подогрели до 37ОС, добавили 0,2 мл подогретого Тромбопластина PT-S, включили генератор. Фиксировали амплитуду на осциллографе и при изменении амплитуды более чем на 20% определяли время свертывания.

Для измерения АЧТВ использовался набор для определения АЧТВ К-350 (PZ Сormay S.A. (Польша)) и Calcium Chloride0,025 М(HemosIL).

АЧТВ анализ измеряет время свертывания анализируемой плазмы после добавления АЧТВ реагента, инкубации в течение «периода активации», по истечении которого добавляется хлорид кальция. 40%-й и ниже дефицит факторов VIII, IX, XI и XII вызывает увеличение АЧТВ. Гепарин в присутствии адекватного количества AT-III также удлиняет время свертывания в данной методике.

Для проведения анализа подогрели хлорид кальция0,025 Мдо 370С и осторожно перемешали. Поместили 0,1 мл исследуемой плазмы в кювету и подогрели до 370С, добавили 0,1 мл реагента АЧТВ в исследуемую плазму, перемешали и включили таймер. Инкубировали смесь плазма-реагент 5 минут (время активации) при 370С. Энергично добавили 0,1 мл подогретого хлорида кальция0,025 Ми включили генератор. Фиксировали амплитуду на осциллографе, при изменении амплитуды более чем на 20% определяли время свертывания крови.

Для проведения исследований параметров гемостаза с помощью акустических колебаний была выбрана кювета серийных приборов отечественного производства № 20021 (ЗАО «СОЛАР»), т.к. она:

– используется в четырехканальном СТ 2410 и турбидиметрическом CGL 2110 гемокоагулометрах, что позволило использовать якоря магнитные одноразовые № 20022 (ЗАО «СОЛАР»);

– обладает малым коэффициентом затухания УЗ на резонансной частоте, что позволило увеличить чувствительность экспериментальной установки.

Было установлено, что оптимальная частота УЗ колебаний зависит от диаметра кюветы и определяется соотношением:

Расчетная частота УЗ для контроля параметров гемостаза в предложенных условиях – 600 кГц.

Для проверки оптимальной частоты УЗ 600 кГц было предложено построить передаточную характеристику для кюветы со сгустком плазмы и сравнить с передаточной характеристикой кюветы с плазмой (рис. 3).

Для образования сгустка использовался метод измерения АЧТВ. По результатам измерения установлено, что при измерении параметров гемостаза для данной кюветы частота УЗ для контроля параметров гемостаза 600 кГц является оптимальной.

Проведено 23 исследования с плазмой крови различных групп и резус факторов. Построенная зависимость напряжения на УЗ датчике от времени при измерении АЧТВ (рис. 4) позволяет регистрировать образование сгустка во времени по значительному изменению выходного параметра. Среднее время образования сгустка в момент падения амплитуды на 20 % составило 32±3 с.

Напряжение на УЗ датчике (см. рис. 1) в начальный момент времени составляло 96±10 мВ. Изменение напряжения на УЗ датчике происходило только при образовании сгустка. Данная методика не позволяет исследовать процесс сворачивания плазмы крови во времени, что связано с использованием УЗ низкой частотой. Сигнал с частотой 600 кГц не затухает при образовании отдельных нитей фибриногена, т.к. их размер соответствует более высокой резонансной частоте сигнала.

При образовании сгустка напряжение на УЗ датчике уменьшилось до 67±10 мВ или на 30,2 %.

Зависимость напряжения на УЗ датчике от времени при измерении ПТВ (рис. 5) показывает образование сгустка во времени. Среднее время образования сгустка в мо-мент падения амплитуды на 20 % составило 13±1 с.

Напряжение на выходном датчике в начальный момент времени составляло 51±7 мВ. При образовании сгустка напряжении уменьшилось до 38±7 мВ. Как и при измерении АЧТВ, изменение напряжения на УЗ датчике происходило только при образовании сгустка в кювете.

Разница между выходными напряжениями при измерении АЧТВ и ПТВ можно объяснить различием проб в кювете. При измерении АЧТВ в начальный момент из-мерения в кювете находилась плазма вместе с реагентом для измерения АЧТВ, а при измерении ПТВ в кювете находилась только плазма.

Для проверки достоверности результатов исследования параметров гемостаза с помощью ультразвука, предложено сравнить их с результатами аналогичных ис-следований на сертифицированном оборудовании.

Для верификации результатов исседований был выбран гемокоагулометр CGL 2110, реализующий турбидиметрический метод (рис. 6), т.к. в нем используются кюветы № 20021 (ЗАО «СОЛАР»), идентичные примененным в устройстве контроля затухания амплитуды ультразвука.

Гемокоагулометр турбидиметрический CGL 2110 предназначен для определения тромбинового времени, протромбинового времени, АЧТВ, концентрации фибриногена и активности факторов свертывания крови.

Для сравнительного анализа использовались образцы и реагенты из одной партии, исследования проводились в одном и том же помещении, при одних и тех же параметров микроклимата. Разница в проведении исследований не превышала 5 минут.

Проведено по пять измерений АЧТВ и ПТВ по стандартному и предложенному авторами методам (таблица 1).

	УЗ метод	CGL 2110	Отклонение параметров
АЧТВ, с	32,0±3	34,2±2	6%
ПТВ, с	13,0±1	13,4±1	3%

Таблица 1. Сравнительный анализ параметров гемостаза

По результатам исследований можно сделать вывод о том, что значения параметров гемостаза, полученные с помощью предложенного авторами метода, основанного на применении УЗ колебаний для контроля состояния плазмы, соответствуют данным, полученным на сертифицированном гемокоагулометре CGL 2110.

Выводы

Результаты исследований показали, что:

– при измерении АЧТВ амплитуда УЗ колебаний одномоментно уменьшается в среднем на 30 %, при измерении ПТВ – на 25 %;

– использование УЗ колебаний для определения параметров гемостаза позволяет точно зафиксировать измеряемые значения за счет малой частоты УЗ.

Таким образом, мы доказали возможность и эффективность применения УЗ методов для исследования параметров гемостаза.

Использование УЗ колебаний для контроля параметров гемостаза позволит:

– создавать приборы с меньшими габаритными размерами, за счет упрощения схемотехнических решений;

– проводить исследования без предварительной подготовки проб крови, что позволит сократить время измерения;

– использовать УЗ коагулометры «у кровати» пациента, вне зависимости от его местонахождения.

Литература

1. Долгов, В. В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза / В. В. Долгов, П. В. Свирин. – М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2005. — 227 с.

2. Зубовская, Е. Т. Методы исследования системы гемостаза / Е. Т. Зубовская, С. Г. Светлицкая – Минск: БелМАПО, 2005. 365 с.

 

П.В. КАМЛАЧ, ассистент кафедры

экологии УО «БГУИР»

В.М. БОНДАРИК, декан факультета

непрерывного и дистанционного обучения

УО «БГУИР»

Ю.Г. ДЕГТЯРЕВ, доцент кафедры

детской хирургии УО «БГМУ»